Po kilku latach pracy jako inspektor kolejowy z bratem, życie Wallace'a odmieniło spotkanie z Henrym Walterem Batesem w Leicester w 1847 roku.
Amazonka
Wallace i Bates przedyskutowali pomysł ekspedycji do Amazonii. Plan zakładał pokrycie kosztów poprzez wysłanie okazów z powrotem do Londynu, gdzie agent sprzedałby je za prowizję. Ponadto podróżnicy mieli "zebrać fakty w celu rozwiązania problemu pochodzenia gatunków", jak to ujął Wallace w liście do Batesa. Dwaj przyjaciele, którzy byli już doświadczonymi entomologami amatorami, spotkali się w Londynie, aby przygotować się do podróży, oglądając południowoamerykańskie rośliny i zwierzęta w głównych kolekcjach.
Bates i Wallace wypłynęli z Liverpoolu w kwietniu 1848 roku, przybywając do Pará (obecnie Belém) pod koniec maja. Przez pierwszy rok mieszkali w willi w pobliżu miasta, zbierając ptaki i owady. Potem uzgodnili, że będą zbierać niezależnie.
Wallace kontynuował badania Amazonii przez cztery lata, zbierając okazy i robiąc notatki o ludziach, językach, geografii, florze i faunie. 12 lipca 1852 roku Wallace wyruszył do Anglii na pokładzie brygu Helen. Po dwudziestu ośmiu dniach na morzu, balsam w ładunku statku zapalił się i załoga została zmuszona do opuszczenia statku. Wszystkie okazy, które Wallace miał na statku, większość jego kolekcji, zostały utracone. Udało mu się ocalić jedynie część dziennika i kilka szkiców. Wallace wraz z załogą spędził dziesięć dni w otwartej łodzi, zanim został wyłowiony przez bryg Jordeson.
Indie Wschodnie
Od 1854 do 1862 roku, w wieku od 31 do 39 lat, Wallace podróżował po Holenderskich Indiach Wschodnich (obecnie Malezja i Indonezja), aby zbierać okazy na sprzedaż i badać przyrodę. Wallace zebrał ponad 125 000 okazów w Holenderskich Indiach Wschodnich (ponad 80 000 samych chrząszczy). Ponad tysiąc z nich reprezentowało gatunki nowe dla nauki.
Jego obserwacje wyraźnych różnic zoologicznych w wąskiej cieśninie archipelagu doprowadziły do zaproponowania przez niego granicy zoogeograficznej, znanej obecnie jako Linia Wallace'a. Bali i Lombok były dwiema wyspami archipelagu oddalonymi od siebie o zaledwie 17 mil w najszerszym miejscu (28 km), mniej więcej tej samej wielkości i o tym samym klimacie, glebie, wzniesieniu i ukształtowaniu terenu. Jednak ich flora i fauna były tak różne.
"W tym archipelagu istnieją dwie odrębne fauny sztywno określone, które różnią się tak bardzo, jak te z Afryki i Ameryki Południowej ... a jednak nie ma nic na mapie lub na powierzchni wysp, aby zaznaczyć ich granice. Linia graniczna przebiega pomiędzy wyspami położonymi bliżej siebie niż inne należące do tej samej grupy. Wierzę, że zachodnia część jest oddzieloną częścią kontynentalnej Azji, podczas gdy wschodnia jest fragmentarycznym przedłużeniem dawnego zachodniego kontynentu Pacyfiku".
Dlaczego, zastanawiał się, zwierzęta i rośliny po stronie Bali były typu azjatyckiego, podczas gdy te po stronie Lombok były typu australijskiego? Musiało to oznaczać, że zachodnia grupa wyewoluowała ze wspólnych zachodnich zasobów, podczas gdy wschodnia grupa wyewoluowała ze wspólnych wschodnich zasobów.
Badając archipelag, udoskonalił swoje myśli o ewolucji i miał słynne spostrzeżenia na temat doboru naturalnego. W 1858 r. wysłał Darwinowi artykuł przedstawiający jego teorię; został on opublikowany, wraz z opisem teorii Darwina, w tym samym roku.
Relacje z jego badań i przygód zostały ostatecznie opublikowane w 1869 roku jako The Malay Archipelago. Stała się ona jednym z najpopularniejszych dzienników podróżniczych o tematyce przyrodniczej w XIX wieku. Był chwalony przez Karola Darwina i Charlesa Lyella, a także przez innych, takich jak powieściopisarz Joseph Conrad, który nazwał go swoim "ulubionym towarzyszem przy łóżku".