Enzym restrykcyjny jest enzymem, który tnie DNA w określonych miejscach. Działa on w pobliżu określonych rozpoznawczych sekwencji nukleotydów, zwanych "miejscami restrykcyjnymi". Aby przeciąć DNA, wszystkie enzymy restrykcyjne wykonują dwa nacięcia, raz przez każdą z nici podwójnej helisy DNA.

Enzymy te występują u bakterii i archaii i bronią je przed inwazją wirusów, którymi są bakteriofagi.

Wewnątrz prokariota, enzymy restrykcyjne selektywnie tną obce DNA w procesie zwanym restrykcją. DNA gospodarza jest chronione przez inny enzym, który chroni DNA gospodarza i blokuje rozszczepianie. Te dwa procesy razem tworzą system modyfikacji restrykcyjnych. Jest to najwcześniejszy i najprostszy system odpornościowy. Są one również rodzajem samolubnego, mobilnego elementu genetycznego.

Ponad 3000 enzymów restrykcyjnych zostało szczegółowo przebadanych, a ponad 600 z nich jest dostępnych komercyjnie. Enzymy te są rutynowo stosowane w laboratoriach do modyfikacji DNA i stanowią istotne narzędzie w klonowaniu molekularnym.