Klonowanie molekularne jest rodzajem pracy w biologii molekularnej. Wykorzystuje się go do tworzenia rekombinowanych molekuł DNA i kierowania ich replikacją w organizmach żywicieli. Użycie słowa klonowanie oznacza, że molekuła DNA z jednej żywej komórki jest używana do stworzenia dużej populacji komórek zawierających identyczne molekuły DNA. Metody klonowania molekularnego mają kluczowe znaczenie dla wielu dziedzin współczesnej biologii i medycyny.
Klonowanie molekularne zazwyczaj wykorzystuje sekwencje DNA dwóch różnych organizmów: gatunek, który jest źródłem DNA do klonowania oraz gatunek, który będzie żywym gospodarzem do rozmnażania (replikacji) rekombinowanego DNA.
W molekularnym eksperymencie klonowania DNA, które ma być sklonowane, otrzymuje się z interesującego nas organizmu, a następnie poddaje się je działaniu enzymów w probówce testowej w celu uzyskania mniejszych fragmentów DNA. Fragmenty te są następnie łączone z wektorowym DNA w celu wytworzenia rekombinowanych molekuł DNA. Rekombinowane DNA jest następnie wprowadzane do organizmu gospodarza (zwykle jest to łatwy do uprawy, łagodny, laboratoryjny szczep bakterii E. coli). W ten sposób powstaje populacja organizmów, w których rekombinowane molekuły DNA są replikowane wraz z DNA gospodarza. Ponieważ zawierają one obce fragmenty DNA, są to mikroorganizmy "transgeniczne" lub zmodyfikowane genetycznie (GMO).
Proces ten wykorzystuje fakt, że pojedyncza komórka bakteryjna może zostać zaindukowana do pobrania i replikacji pojedynczej rekombinowanej cząsteczki DNA. Ta pojedyncza komórka może być następnie rozszerzona wykładniczo w celu wygenerowania dużej ilości bakterii, z których każda zawiera kopie oryginalnej rekombinowanej cząsteczki. Tak więc zarówno powstała w ten sposób populacja bakterii, jak i rekombinowana cząsteczka DNA, są powszechnie nazywane "klonami". Ściśle mówiąc, rekombinowane DNA odnosi się do cząsteczek DNA, podczas gdy klonowanie molekularne odnosi się do eksperymentalnych metod stosowanych do ich złożenia.