Nukleazy z motywem palca cynkowego
Nukleazy palca cynkowego (lub ZFN) są narzędziem wykorzystywanym do namierzania genów i zmiany DNA. Jest to jedna z trzech metod zmiany genomu za pomocą zaprojektowanych nukleaz.
Składają się one z dwóch części. Palce cynkowe to stworzone przez człowieka cząsteczki składające się z białka i cynku. Każda z nich wiąże się z określonym DNA. Nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) to enzymy powstałe w wyniku połączenia palca cynkowego z enzymem rozszczepiającym DNA zwanym Fokl. Tak więc ZFN wiąże się z określoną sekwencją DNA, a następnie przecina ją w dwóch miejscach. Zwykłe enzymy komórkowe sklejają końce, pomijając odcięty fragment (naprawa DNA).
Każdy ZFN jest przeznaczony do użycia na jednym genie, który jest nazywany "genem docelowym" lub "docelowym DNA". Mogą one być zaprojektowane do pracy na konkretnych częściach genów, aby stworzyć pożądaną zmianę. Dwa rodzaje zmian w DNA to mutacje, takie jak delecje i insercje. W badaniach genetyki bada się zmutowane obiekty zwierzęce, aby dowiedzieć się, co robi dany gen.
Trójwymiarowa reprezentacja cząsteczki palca cynkowego. Palce cynkowe są zaznaczone na niebiesko, a jon cynku na zielono.
Struktura palca cynkowego
Palec cynkowy" to nazwa wielu struktur białkowych. Atom cynku wiąże białka i czyni je bardziej stabilnymi. ZFN wiążą się z parami zasad DNA. Jeden palec cynkowy może samodzielnie związać około 3 par zasad.
Funkcja ZFN
Nukleazy z palcem cynkowym zbudowane są z 3-6 palców cynkowych. ZFN posiadają dwie ważne domeny: domenę wiążącą DNA i domenę rozszczepiającą DNA. Domena rozszczepiająca DNA wykorzystuje enzym zwany Fokl, który rozbija DNA.
ZFN mogą zmieniać tylko sekwencje DNA, do których zostały zaprojektowane. Domena wiążąca DNA wiąże się z konkretną sekwencją DNA. Dwa ZFN zaprojektowane dla tej samej sekwencji DNA są potrzebne do zmiany jednego genu. Domeny wiążące DNA wiążą się do obu nici na podwójnej helisie DNA. Domeny rozszczepiające DNA przerywają nić DNA i wycinają pary zasad genu. Komórki same naprawiają uszkodzone nici DNA za pomocą naprawy DNA. Mutacje delecyjne wynikają z brakujących par zasad po naprawie DNA.
Długość docelowej sekwencji genu może być również określona. Minimum 9 par zasad może być zmienione przy użyciu 3 palców cynkowych. Jest to przydatne do usuwania i wstawiania bardzo krótkich sekwencji DNA i określania ich wpływu na gen docelowy. Również duże sekwencje mogą być zmieniane przy użyciu więcej niż jednego ZFN.
Zastosowanie ZFNs
ZFN były używane do odkrywania funkcji genów w wielu badaniach genetycznych. ZFN mogą być używane do zmiany DNA na każdym gatunku. Inną cechą ZFN jest to, że mogą być stosowane in vivo (w żywych organizmach). Obecnie stosuje się je na organizmach modelowych: roślinach, owadach i rybach.
Lista organizmów zaangażowanych w badania nad zmianami genów ZFN obejmuje:
- Arabidopsis
- Bydło
- C. elegans
- Kukurydza
- Drosophila melanogaster
- Żabki
- Myszy
- Świnie
- Króliki
- Szczury
- Jeżowce
- Jedwabniki
- Soja
- Tytoń
- Zebrafish
Problemy z wykorzystaniem ZFN
Największym problemem związanym z ZFN jest przypadkowa zmiana genów poza genem docelowym. ZFN musi być wykonany tak, aby znaleźć odpowiednie pary zasad na genie docelowym. Te pary zasad są tak dobrane, że tylko gen docelowy będzie je posiadał. Domeny rozszczepiające DNA działają na dowolnej sekwencji DNA, więc wiązanie się z niewłaściwą sekwencją genu spowoduje jej zmianę. ZFN, które wybijają pary zasad dla więcej niż jednego genu, nie są uważane za dokładne.
Pytania i odpowiedzi
P: Czym są nukleazy z palcem cynkowym lub ZFN?
O: Nukleazy z palcem cynkowym lub ZFN to narzędzie wykorzystywane do namierzania genów i zmiany DNA.
P: Jakie są trzy metody zmiany genomu za pomocą zmodyfikowanych nukleaz?
O: Nukleazy z palcem cynkowym (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) i klasteryzowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromowe (CRISPR) to trzy metody zmiany genomu za pomocą zmodyfikowanych nukleaz.
P: Czym są palce cynkowe?
O: Palce cynkowe to stworzone przez człowieka cząsteczki zbudowane z białka i cynku, które wiążą się z określonym DNA.
P: Co to są nukleazy z palcem cynkowym (ZFN)?
O: Nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) to enzymy, które powstają w wyniku połączenia palca cynkowego z enzymem rozszczepiającym DNA zwanym Fokl.
P: Co się dzieje, gdy ZFN wiąże się z określoną sekwencją DNA?
O: Kiedy ZFN wiąże się z określoną sekwencją DNA, przecina ją w dwóch miejscach.
P: Co robią zwykłe enzymy komórkowe po wycięciu DNA?
O: Zwykłe enzymy komórkowe sklejają końce, pomijając wycięty fragment (naprawa DNA).
P: Jakie są dwa rodzaje zmian w DNA, których mogą dokonać nukleazy z palcem cynkowym lub ZFN?
O: Nukleazy z palcem cynkowym lub ZFN mogą wprowadzać dwa rodzaje zmian w DNA: mutacje, takie jak delecje i insercje.
