Konstantyn zaprosił wszystkich 1800 biskupów kościoła chrześcijańskiego (około 1000 na wschodzie i 800 na zachodzie), ale tylko 250 do 320 biskupów faktycznie wzięło udział w soborze. Euzebiusz z Cezarei naliczył 250, Atanazy z Aleksandrii 318, a Eustacjusz z Antiochii 270 (wszyscy trzej byli obecni na soborze). Później Sokrates Scholastyk zanotował ponad 300, a Ewagriusz, Hilariusz, Jerome i Rufinus - 318.
Biskupi otrzymali darmową podróż na sobór, jak również zakwaterowanie. Biskupi nie podróżowali sami; każdy z nich miał prawo zabrać ze sobą dwóch kapłanów i trzech diakonów, tak więc całkowita liczba uczestników mogła wynosić ponad 1500 osób. Euzebiusz mówi o niemal nieprzeliczonej rzeszy towarzyszących im kapłanów, diakonów i akolitów.
Szczególne znaczenie nadano temu soborowi również dlatego, że prześladowania chrześcijan zakończyły się właśnie wraz z Edyktem Mediolańskim z lutego 313 r., wydanym przez cesarzy Konstantyna i Licyniusza.
Biskupi wschodni stanowili zdecydowaną większość. Spośród nich pierwsze miejsce zajmowali trzej patriarchowie: Aleksander z Aleksandrii, Eustacjusz z Antiochii i Makary z Jerozolimy. Prowincje łacińskojęzyczne wysłały co najmniej pięciu przedstawicieli: Marek z Kalabrii z Italii, Cecylian z Kartaginy z Afryki, Hozjusz z Kordoby z Hispanii, Nikasjusz z Dijon z Galii i Domnus ze Stridonu z prowincji naddunajskiej. Papież Sylwester I nie był obecny, ponieważ był chory, ale reprezentowało go dwóch kapłanów.
Atanazy z Aleksandrii, młody diakon i towarzysz biskupa Aleksandra Aleksandryjskiego, był wśród asystentów. Atanazy ostatecznie spędził większość życia na walce z arianizmem. Aleksander z Konstantynopola, wówczas prezbiter, był również obecny jako przedstawiciel swojego sędziwego biskupa.