Ukierunkowana ewolucja
Ewolucja ukierunkowana (DE) jest metodą stosowaną do produkcji enzymów do celów przemysłowych lub medycznych.
Metoda ta to inżynieria proteinowa, która naśladuje selekcję naturalną.
Podstawową ideą jest przeprowadzenie genu przez powtarzające się rundy mutacji, stworzenie biblioteki wariantów. Selekcja izoluje geny z pożądaną funkcją. Stanowią one szablon dla następnej rundy.
Można to zrobić in vivo (w żywych komórkach bakterii lub drożdży), lub in vitro (wolne w roztworze lub mikrokroplety).
Badanie większej ilości mutantów zwiększa szanse na znalezienie jednego z pożądanych właściwości.
Podczas ewolucji in vivo każda komórka (zwykle bakterie lub drożdże) jest przekształcana za pomocą plazmidu zawierającego innego członka biblioteki wariantu. Pomiędzy komórkami różni się tylko gen interesujący, przy czym wszystkie inne geny są takie same.
Komórki wyrażają białko albo w swojej cytoplazmie, albo na powierzchni, gdzie można zbadać jego funkcję. Format ten ma tę zaletę, że wybiera właściwości w środowisku komórkowym, co jest użyteczne, gdy wyewoluowane białko lub RNA ma być wykorzystane w żywych organizmach.
Gdy wykonywane są bez komórek, DE wykorzystuje tłumaczenie transkrypcji in vitro do produkcji białek lub RNA wolnych w roztworze lub wewnątrz sztucznych mikrokropelek. Ma to tę zaletę, że dopuszcza więcej warunków (np. temperaturę, rozpuszczalniki). Może on wyrażać białka, które byłyby toksyczne dla komórek. Co więcej, eksperymenty z ewolucją in vitro mogą generować znacznie większe biblioteki (do 1015), ponieważ DNA biblioteki nie musi być wprowadzane do komórek. To często ogranicza to, co można zrobić.
Przykład ukierunkowanej ewolucji w porównaniu z ewolucją naturalną. Cykl wewnętrzny pokazuje trzy etapy cyklu ewolucji ukierunkowanej z naśladowaniem procesu naturalnego w nawiasach. Okrąg zewnętrzny pokazuje kroki w typowym eksperymencie. Czerwone symbole oznaczają warianty funkcjonalne, blade - warianty o zredukowanej funkcji.
Zapewnienie dziedziczności
Gdy białka funkcjonalne zostały wyizolowane, konieczne jest, aby ich geny były również ich genami, dlatego wymagane jest połączenie genotyp-fenotyp.
Może to być kowalencyjne, gdzie gen mRNA jest połączony z białkiem na końcu tłumaczenia przez puromycynę.
Alternatywnie, białko i jego gen mogą być trzymane razem, lub w kroplach emulsji. Wyizolowane sekwencje genów są następnie rozmnażane za pomocą PCR lub przez przekształcone bakterie gospodarza. Albo pojedyncza najlepsza sekwencja, albo pula sekwencji może być użyta jako wzorzec dla następnej rundy mutagenezy. Powtarzające się cykle zróżnicowania-selekcji-amplifikacji powodują, że warianty enzymatyczne są dostosowane do procesu selekcji.
Wyrażone białko może być połączone kowalencyjnie z jego genem (jak w mRNA), po lewej stronie, lub umieszczone w tej samej komorze z nim, po prawej stronie. Tak czy inaczej, gen, który koduje białko, jest izolowany
Nagroda przyznana
Amerykański inżynier FrancesArnold otrzymał nagrodę Millennium Technology Prize za pionierską, ukierunkowaną ewolucję.
Pytania i odpowiedzi
P: Co to jest ewolucja ukierunkowana?
O: Ewolucja kierowana (DE) jest metodą stosowaną do produkcji enzymów dla celów przemysłowych lub medycznych. Jest to forma inżynierii białek, która naśladuje dobór naturalny.
P: Jak działa ewolucja kierowana?
O: Ewolucja ukierunkowana polega na poddawaniu genu wielokrotnym mutacjom, tworząc bibliotekę wariantów. Selekcja wyodrębnia geny o pożądanej funkcji, które są następnie wykorzystywane jako szablony do następnej rundy.
P: Gdzie można przeprowadzić ewolucję ukierunkowaną?
O: Ewolucję ukierunkowaną można przeprowadzać in vivo (w żywych komórkach bakterii lub drożdży) lub in vitro (w roztworze lub mikrokroplach).
P: Jakie są zalety prowadzenia ewolucji kierowanej in vivo?
O: Zaletą ewolucji kierowanej in vivo jest możliwość wyboru właściwości w środowisku komórkowym, co jest przydatne, gdy wyewoluowane białko lub RNA ma być wykorzystane w organizmach żywych.
P: Jakie są zalety prowadzenia ukierunkowanej ewolucji in vitro?
O: Zaletą ewolucji kierowanej w warunkach in vitro jest to, że pozwala ona na stworzenie większej liczby warunków (np. temperatura, rozpuszczalniki) i umożliwia ekspresję białek, które byłyby toksyczne dla komórek. Ponadto można generować znacznie większe biblioteki, ponieważ DNA nie musi być wprowadzane do komórek.
P: Co ogranicza to, co można zrobić podczas eksperymentu in vitro?
O: Limit wielkościowy tego, co można zrobić podczas eksperymentu in vitro, jest często określony przez to, ile DNA trzeba wprowadzić do komórek.
