ELISA: definicja, zasada działania i zastosowania (test immunoenzymatyczny)

ELISA: definicja, zasada działania i zastosowania — praktyczny przewodnik po teście immunoenzymatycznym, czułość, interpretacja wyników i zastosowania w diagnostyce.

Metoda ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay, zwana też EIA) jest techniką stosowaną w biochemii w celu określenia, czy dana substancja — na przykład specyficzna cytokina lub antygen - jest obecna w próbce. Test opiera się na specyficznej reakcji przeciwciało–antygen oraz na układzie enzym‑substrat, co umożliwia wykrycie i często zmierzenie ilości docelowej cząsteczki.

Technika ta wykorzystuje specjalne przeciwciała, które przyczepiają się do substancji. Przeciwciała te są sprzężone bezpośrednio lub pośrednio z enzymem, który po dodaniu odpowiedniego substratu generuje widoczny sygnał (najczęściej kolor). Intensywność koloru koreluje z ilością obecnej substancji w próbce. W niektórych wariantach wykrywanie odbywa się za pomocą sygnału fluorescencyjnego lub chemiluminescencyjnego; czasami konieczne jest użycie światła ultrafioletowego, aby zobaczyć produkt reakcji.

Zasada działania i typowe etapy testu

• Płytka mikrodołkowa: reakcje przeprowadza się zwykle w płytkach polistyrenowych z kilkudziesięcioma dołkami (np. 96‑dołkowe).
• Powlekanie (coating): do dołków przytwierdza się antygen lub przeciwciało „uchwytowe”, zależnie od formatu testu.
• Blokowanie: wolne miejsca na powierzchni płytki blokuje się białkami (np. BSA, mleko odtłuszczone), by zmniejszyć niespecyficzne wiązanie.
• Dodanie próbek i odczynników: dodaje się próbki (surowica, osocze, hodowla komórkowa itp.) oraz standardy o znanych stężeniach, które posłużą do przygotowania krzywej kalibracyjnej.
• Wiązanie detekcyjne: dodaje się przeciwciało sprzężone z enzymem (bezpośrednio lub za pomocą przeciwciała wtórnego), które wiąże się z analizowaną substancją.
• Mycie: po każdym etapie usuwa się nierozwiązane komponenty przy użyciu buforów myjących, by zwiększyć czułość i specyficzność.
• Reakcja enzymatyczna: dodaje się substrat dla enzymu (np. TMB dla peroksydazy chrzanowej — HRP). Powstały produkt barwny mierzy się spektrofotometrycznie (np. przy 450 nm po zatrzymaniu reakcji kwasem).
• Analiza: przy pomocy krzywej wzorcowej określa się stężenie analizowanej substancji w próbkach.

Główne formaty ELISA

• Direct (bezpośredni): przeciwciało sprzężone z enzymem bezpośrednio wykrywa antygen. Prosty, ale mniej czuły.
• Indirect (pośredni): antygen wykrywany jest przez nieoznakowane przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie przez znakowane przeciwciało wtórne — zwiększa sygnał i elastyczność.
• Sandwich (kanapkowy): stosowany, gdy analizowany antygen ma co najmniej dwa epitopy; jeden przeciwciało „wychwytuje”, drugi — znakowany — detekuje. Bardzo czuły i specyficzny dla matryc biologicznych.
• Competitive (konkurencyjny): stosowany dla małych antygenów, gdzie signał jest odwrotnie proporcjonalny do ilości analitu w próbce.

Rodzaje detekcji

• Kolorometryczna: najczęściej stosowana; pomiar absorbancji powstałego barwnika (np. TMB/HRP przy 450 nm, pNPP/AP przy ~405 nm).
• Fluorescencyjna: używana tam, gdzie wymagana jest większa czułość lub multiplexing.
• Chemiluminescencyjna: bardzo czuła metoda, często wykorzystywana w testach diagnostycznych o niskich stężeniach analitu.

Zastosowania

• Diagnostyka medyczna: wykrywanie przeciwciał przeciwko patogenom (np. wirusy, bakterie), pomiar markerów chorobowych.
• Badania immunologiczne: oznaczanie poziomów cytokin, przeciwciał, receptorów.
• Kontrola jakości i testy środowiskowe: wykrywanie toksyn, alergenów, zanieczyszczeń.
• Badania endokrynologiczne: pomiar hormonów.
• Prace nad szczepionkami i serologią: ocena odpowiedzi immunologicznej.
• W laboratoriach badawczych ELISA często uzupełnia lub jest punktem wyjścia dla technik komórkowych takich jak ELISPOT.

Zalety i ograniczenia

• Zalety: wysoka czułość i specyficzność (szczególnie w formacie sandwich), możliwość ilościowego oznaczenia, wysoka przepustowość (96‑dołkowe płytki), relatywnie niski koszt odczynników.
• Ograniczenia: możliwe niespecyficzne wiązanie i cross‑reaktywność przeciwciał, efekt „hook” przy bardzo wysokich stężeniach antygenu, wpływ matrycy próbki (np. hemoliza, lipemia), potrzeba dobrych kontroli i kalibracji.

Kontrole i jakość wyników

Aby wynik był wiarygodny, w każdym teście ELISA powinno się stosować: kontrolę dodatnią, kontrolę ujemną (blanka), serie standardów do krzywej kalibracyjnej oraz powtórzenia techniczne (replicates). Ważne są też prawidłowa procedura mycia i jednolite warunki inkubacji.

Praktyczne wskazówki

• Próbki często trzeba rozcieńczać (dilucje seryjne) tak, aby mieściły się w zakresie liniowym krzywej wzorcowej.
• Unikać pęcherzyków powietrza przy dodawaniu odczynników; dokładne mycie dołków zmniejsza tło.
• Stosować odpowiednie czasy i temperatury inkubacji zalecane w protokole kitów oraz przechowywać sprzężone przeciwciała zgodnie z instrukcjami producenta.
• Znajomość widma substratu i użycie właściwej długości fali w czytniku (np. 450 nm dla TMB) jest kluczowe dla poprawnego pomiaru.
• W razie wątpliwości przeprowadzić test powtórny i sprawdzić konsystencję wyników między powtórzeniami.

Metoda ELISA jest fundamentem wielu badań naukowych i procedur diagnostycznych dzięki swojej wszechstronności i możliwości ilościowego pomiaru biomarkerów. Wybór odpowiedniego formatu, dbałość o jakość odczynników oraz prawidłowa interpretacja krzywej kalibracyjnej są kluczowe dla uzyskania rzetelnych wyników.

Pytania i odpowiedzi

P: Co to jest ELISA?

P: Jak działa test ELISA?

P: Jakie substancje może wykryć test ELISA?

P: Co wskazuje ilość koloru generowanego przez test ELISA?

P: Czy test ELISA jest jedyną techniką stosowaną do wykrywania określonych substancji w próbce?

P: Jaka jest rola drugiego zestawu przeciwciał stosowanego w teście ELISA?

P: Czy test ELISA zawsze generuje kolor po wykryciu substancji?

Szukaj według litery